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组学数据向来是高质量期刊较为看重的假说验证证据，涉及的多组学实验环节越丰富，对于现象机制的探究往往更为完整和具体。在植物抗病机制研究领域，测序和代谢组分析手段已非罕见，要寻找新的创新点和研究亮点，还需要再挖掘其他角度。

本期优秀客户文章解读，看磷酸化蛋白质组和纳米材料两大热点，如何为这篇发表于Journal of Cleaner Production的植物方向课题加分！

研究对象：R. solanacearum菌株、烟草植株、铋-硒纳米复合簇

技术方法：非靶代谢组、真核转录组、RT-qPCR、磷酸化修饰蛋白质组等

研究思路：

技术路线图

1.Bi-Se NPs纳米复合簇表征

在氮气保护下，Bi NPs和Se NPs通过静电相互作用结合形成Bi-Se NPs。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察结果显示Bi NPs呈片状结构，Se NPs呈均匀球形吸附在Bi NPs结构表面且分布均匀（图1A-C）。XPS和XRD均显示出铋和硒的特征峰（图1G-J）。

图1. Bi-Se NPs的制备与表征

2.Bi-Se NPs的体外抗菌特性

Bi NPs或Se NPs单独处理对R. solanacearum抗菌活性不明显，相比之下，Bi-Se NPs有效抑制了细菌的增殖，菌落总数减少，并显著提高了抗菌效果（图2B）。此外，采用菌落形成单位（CFU）方法检测Bi-Se NPs的抗菌活性（图2C和D）的结果显示Bi-Se NPs组在各实验组中具有最显著的抑制活性。在活/死细胞实验检测中，Bi-Se NPs和20%噻菌铜处理组都显示出了对细菌的根除效果（图2E）。图2F显示Bi-Se NPs对R. solanacearum的细胞膜具有很强的破坏能力，导致细菌出现更多褶皱，达到抗菌效果。

图2. Bi-Se NPs的体外抗菌特性

3.Bi-Se NPs抗菌机制探究

与对照组相比，单独使用Bi NPs或Se NPs不足以引起细菌内活性氧（ROS）爆发造成细菌损伤（图3A-E）。经过Bi-Se NPs处理后，细菌内源性ROS水平显著增加（图3F）。

细菌能够在盖玻片表面形成致密的生物膜以避免抗菌药物的渗透和清除。扫描电子显微镜（SEM）图像证实经过Bi-Se NPs处理后，R. solanacearum的生物膜密度显著降低，面积较小，且抗菌生物膜活性似乎与ROS浓度呈正相关，受到更强的破坏（图3G和H）。与空白组相比，Bi-Se NPs处理组在590 nm处的胞外多糖（EPS）含量在各处理组中降低幅度最大（图3I）。

Bi-Se NPs显著增加了R. solanacearum中的ROS含量，可能影响酶、转运蛋白等物质的功能，导致细菌细胞代谢紊乱，减少EPS产生，从而抑制细菌生物膜的形成，达到抑制细菌的效果。

图3. Bi-Se NPs诱导的活性氧（ROS）爆发和抗生物膜特性

4.不同处理下烟草的生长和理化分析

根部灌溉施用128 ± 5 μg/mL的Bi-Se NPs对添加病原体的烟草生长影响显著（图4A）。烟草植物吸收了Bi-Se NPs，植物高度和叶片数量增加，平均叶宽、茎围和地上部鲜重也相应增加，发病率指数显著降低（图4B-G）。烟草叶片图像显示（图4H和I），经Bi-Se NPs处理组烟草的病变较小，腐烂损伤较轻，有助于烟草的更好生长。

Bi-Se NPs通过降低烟草植物中H₂O₂的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，减少其对植物造成的损害（图5A和B）。此外，原糖和总糖的含量增加的同时降低总碱含量，有助于积累营养物质并支持烟草植物的生长和发育（图5C-E）。Bi-Se NPs的添加还显著增加了烟草叶片中的硒含量（图5F）。经处理组的叶片叶表面褶皱较少，叶脉更粗，叶片展开度更大，生长更为有利（图5G）。

图4. 施用128 ± 5 μg/mL Bi-Se NPs后烟草幼苗的生长

图5. 烟草叶片的生理生化检测和形态学分析

5.不同处理下烟草非靶向代谢组的差异表达分析

正负离子结合代谢物鉴定发现，羧酸及其衍生物的化学分类和归属信息约占所有鉴定差异代谢物的13.4%（图6A）。热图分析结果显示不同处理的样本之间代谢物存在较大差异（图6B）。火山图分析样本之间的差异代谢物（图6C）发现约有240种差异代谢物上调，约115种差异代谢物下调。显著差异代谢物之间的相关性紧密程度分析结果显示，羧酸及其衍生代谢物琥珀酸变异系数约为3倍（图6D和E）。利用KEGG数据库对差异代谢物的途径进行注释，并获得差异代谢物的代谢途径图，其中氧化磷酸化途径富集程度最高（图6F）。进一步分析氧化磷酸化途径（图6G），发现琥珀酸参与了氧化磷酸化途径的运行，加速烟草中氧气和ATP的产生，从而促进机体代谢。

图6. 不同处理组烟草叶片的非靶向代谢组检测

6.不同处理下烟草真核转录组的差异表达分析

转录组学分析显示Bi-Se NPs的存在可以提高烟草中氧化磷酸化途径的运行效率，从而促进烟草的生长和发育。

火山图分析直观地显示了样本之间差异基因的变化，其中约有4239个差异调控基因上调，约5308个差异调控基因下调，并对检测到的差异基因进行热图分析，RT-qPCR验证三个上调基因和一个下调基因结果与转录结果一致（图7A到图7C）。通过GO注释和KEGG数据库对差异基因进行分析，发现氧化磷酸化途径的富集程度最高（图7D和E）。

图7. 不同处理组烟草叶片的真核转录组检测

7.不同处理下烟草磷酸化蛋白质组差异表达分析

不同处理下的烟草生长差异导致了差异蛋白的出现。样本之间差异蛋白的火山图分析（图8A）直观地显示了差异蛋白的变化，其中约有656个差异调控蛋白上调，约320个差异蛋白下调。对检测到的差异蛋白进行热图分析结果如图8B所示。分析差异蛋白在GO注释中的分布，与背景蛋白相比，代谢过程的调控高度富集，约为51（图8C）。对差异蛋白进行KEGG富集分析，其中包含的代谢途径和氧化磷酸化途径高度富集，表明Bi-Se NPs的存在提高了这些途径的运行效率（图8D）。最后，分析了差异蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用网络（图8E），其中与LOC107795313节点对应的核孔蛋白与其他蛋白的相互作用最为密切，表明该蛋白与烟草的生长发育过程密切相关，进一步验证了Bi-Se NPs对烟草代谢的影响。

图8. 不同处理组烟草叶片的磷酸化蛋白质组检测

8.不同处理下烟草多组学分析

综合代谢组学、转录组学和蛋白质组学数据，研究团队发现Bi-Se NPs通过多种途径抗菌并促进烟草生长发育。

转录组与蛋白质组联合分析韦恩图显示了基因和蛋白质之间定量和差异表达的信息，从而得出差异基因和差异蛋白之间的对应关系（图9A）。此外，研究者还根据每个对齐组中蛋白质表达的倍数差异和基因表达的倍数差异计算相关系数，并通过聚类分析可视化了所有可定量的蛋白质和基因之间的关联（图9B和C）。不同样本之间差异基因和差异蛋白存在一定程度的差异。

根据上述数据，GO途径在两种组学中均显著富集（图9D），其中差异蛋白在代谢过程调控中的富集更为显著，差异基因在色素代谢中的富集最为显著。KEGG途径在两种组学数据中均显著富集（图9E），表明植物激素信号转导、泛酸和辅酶A生物合成以及光合作用生物中的碳固定在差异蛋白或差异基因中发生了更显著的变化。

从差异基因和差异蛋白的角度来看，施用128 ± 5 μg/mL的Bi-Se NPs后，植物激素信号转导、泛酸和辅酶A生物合成以及光合作用生物中的碳固定含量显著增加，促进了烟草体内代谢调节，提高了氧化磷酸化途径和光合作用的运行效率，增加了激素信号转导的含量，并提高了琥珀酸和FMN的水平。在生物合成方面，Bi-Se NPs施用促进了烟草的代谢和生长发育能力，抑制了R. solanacearum的活性，降低了烟草青枯病的发病率，表明Bi-Se NPs可以保护烟草免受病原细菌感染，并促进植物的生长发育。

图9. 不同处理组烟草叶片的多组学分析

9.安全性评估

此外，作者还针对Bi-Se NPs的安全性进行了评估。与对照组相比，使用Bi-Se NPs对心肌细胞的正常生长没有显著影响。对小鼠进行的Bi-Se NPs处理也表现出Bi-Se NPs具备低毒性，具有良好的安全性和可靠性。

除了对小鼠的安全性测试外，还对土壤环境中微生物的Bi-Se NPs安全性进行了检查。抑菌圈实验表明合理使用适当浓度的Bi-Se NPs具有良好的生物和环境安全性。