行业动态

植物领域的机制研究正从单一维度向系统化整合迈进，其中“激素检测+多组学+功能验证”的设计思路因其多层次解析能力，正逐步成为高分研究的核心策略。

植物激素检测通过高灵敏度质谱技术追踪植物激素代谢的时空变化，为信号网络提供定量基础；在此基础上整合其他多组学数据（转录组、蛋白组）则能全局性捕捉基因表达、蛋白互作与代谢重编程的协同模式，从海量数据中筛选关键调控节点。进一步拓展的功能验证环节，基因编辑、分子互作（如CO-IP、双荧光素酶系统）等实验，则能够在遗传与生化层面确证靶点功能，建立“激素-基因-表型”的完整假说验证，为文章的完成度再提高一个档次。这一设计思路突破传统单一技术的局限，其系统性、可验证性高度契合顶级期刊对创新性与完整性的要求，已成为揭示新机制、发表高分文章的有效路径。

研究对象：水稻

技术方法：植物激素含量检测、基因编辑、qRT-PCR、miRNA Northern blot、CO-IP、BiFC、Y2H、Dual-LUC等

1.生长素信号激活水稻对褐飞虱的抗性

为了评估生长素在水稻抗褐飞虱中的作用，在褐飞虱处理之前用生长素类似物萘乙酸（NAA）处理水稻幼苗。7至10天后，所有未经NAA处理的植物死亡，0.1μM NAA处理的植株仍然存活，而用1μM NAA治疗的大多数植株也死亡了（图1A），存活率表明低浓度NAA激活了BPH抗性（图1B），但当NAA浓度升高时，促进作用下降（图1C），因此存活率较低（图1D），证实较高浓度NAA处理抑制了水稻植物的褐飞虱抗性。同时，使用抗褐飞虱水稻品种“Rathu Heenati”（RHT）和褐飞虱易感品种“9311”植株，测量了褐飞虱侵染后内源IAA含量。在这两个品种中，IAA含量在BPH侵染后12和24小时下降，RHT的下降幅度大于9311（图1，E和F）。因此，BPH侵染降低了寄主植物中的IAA含量。

图1 生长素与水稻褐飞虱侵染的关系

两种主要的水稻生长素受体编码基因OsTIR1和OsAFB2的表达受BPH侵染诱导，所以构建了OsTIR1和OsAFB2过表达的转基因植物（分别为TIR1OE和AFB2OE）（图2，A和B）和编辑的植物（分别是TIR1KO和AFB2KO）。TIROE-1植物的死亡时间都晚于野生型（WT）植物（图2E和F），并且TIROE-1植物在BPH侵染后的存活率远高于WT（图2G）。同样，TIROE-2植物比WT植物死亡晚（图2，H和I），总体存活率更高（图2J）。相比之下，TIR1KO-1（图2，K和L）和TIR1KO-2植物（图2中，K和N）比野生型植物更早死亡，各自的存活率远低于野生型（图2中的M和O）。AFB2KO-1（图2，P和Q）和AFB2KO-2植株（图2、P和S）比野生型植株早死亡，两个品系的存活率都比野生型低得多（图2：R和T）。因此，生长素激活BPH抗性可能是由OsTIR1和OsAFB2受体介导的。

图2 TIR1OE、TIR1KO、AFB2OE和AFB2KO植物的褐飞虱抗性

2.OsmiR393对生长素信号传导进行转录后调控，并对BPH抗性产生负面影响

为了研究OsmiR393在BPH抗性中的作用，在“日本晴”（NIP）遗传背景下构建了OsMIR393a和OsMIR393b过表达和敲除植物，并进行了验证（图3）。

在个体和小群体试验中，OsmiR393过表达的植物都比野生型植物死亡得早得多（图4A至I），表明其易患BPH。OsmiR393双敲除植物植株比野生型植株晚死亡，表明对褐飞虱的抗性增强（图4J至O），因此，OsmiR393a和OsmiR393b双敲除植物对褐飞虱的抗性增强。

与NIP植物相比，以393bOE植物为食的BPH个体排泄的蜜露量要高得多，而以393DKO-1植物为食料的BPH排泄的蜜露量则大大减少（图4P）。综上所述，这些结果表明生长素信号通路受OsmiR393的转录后调控，OsmiR393负调控水稻对褐飞虱的抗性。

图3 393aOE、393bOE和393DKO的验证和检测

图4 393aOE、393bOE和393DKO植株与野生型植株的褐飞虱抗性比较

3.OsIAA10与OsTIR1相互作用介导BPH抗性

酵母双杂交（Y2H）试验发现许多OsIAA在酵母系统中与OsTIR1-相互作用（图S2）。进一步实验证明OsIAA2、OsIAA7、OsIAA10、OsIAA16和OsIAA24基因在393DKO-1植株中下调，但在393bOE植株中上调（图5A）。响应性表达分析显示，这些基因对BPH感染敏感，OsIAA10表现出最强的诱导反应（图5B）。在个体试验和小群体试验中，IAA10KO-1和IAA10KO-2植株（12株）比“中华11号”（ZH11）野生型植株晚死亡（图5，C，D和F），其各自的存活率高于小群体试验（图5、E和G）中的野生型植株。IAA10OE-1和IAA10OE-2植物比野生型植物更早死亡（图5，H、I和K），它们各自的存活率低于小群体试验的野生型（图5、J和L）。因此，OsIAA10负调控BPH抗性。

图5 OsIAA基因的表达及OsIAA10的遗传功能分析

4.OsARF12在OsTIR1/OsIAA10的下游介导BPH抗性

在Y2H测定中，携带OsIAA10和OsARF12的酵母在SD/-T-L-H-A培养基上生长良好（图6A）。此外，OsIAA10和OsARF12之间的相互作用在LCI（图6B）、BiFC（图6C）和共免疫沉淀（co-IP）检测中得到了验证（图6D）。所有这些生化分析表明，OsIAA10在体外和体内与OsARF12相互作用。因此，OsTIR1/OsIAA10模块可能通过OsARF12发挥作用，介导下游生长素信号传导。

在个体和小群体试验的测试中，ARF12过表达和敲除植株的死亡时间和存活率统计以及BPH个体排泄的蜜露量统计结果表明，OsARF12正向调节BPH抗性（图6E-P）。在单独测试中，杂交植物393DKOk/ARF12KOk比393DKOk植物更容易感染BPH，其状态与野生型植物相似（图6Q）。因此，393DKOk植株的褐飞虱抗性依赖于OsARF12基因。

图6 OsIAA10和OsARF12的相互作用验证以及OsARF12的遗传功能分析

5.OsARF12基因激活下游基因OsRbohB

BPH感染严重影响了七个基因的表达，其中OsRbohB的诱导是最明显的变化（图7A）。利用OsRbohB突变体的BPH抗性来研究OsRbohB在BPH抗性中的作用。在BPH侵染之前，osrbohB突变体中的H₂O₂含量低于NIP，如3,3′-二氨基联苯胺（DAB）染色和H₂O₂含量测量所示（图7，B和C）。BPH侵染激活了osrbohB突变体和NIP植物中H₂O₂的积累，但osrbohB突变体植物中的激活程度与NIP植物不可比（图7，B和D）。因此，OsRbohB基因通过H2O2的积累正向调节BPH抗性。

利用GAL4系统检测OsARF12的转录激活效果，将OsARF12的全长编码序列与GAL4BD融合，并在35S启动子的控制下进行表达。结果显示，GAL4BD-ARF12的荧光素酶活性明显高于负对照，表明OsARF12具有转录激活功能。接着，通过表达分析发现ARF12过表达（ARF12OE）的植物中OsRbohB基因上调，而在ARF12缺失（ARF12KO）的植物中则下调，提示OsARF12可能调控OsRbohB。此外，在393DKO（双基因缺失）植物中OsRbohB上调，而在393aOE和393bOE植物中下调，表明OsRbohB可能参与OsmiR393介导的信号通路。还确认了OsARF12能够结合OsRbohB启动子的DNA结合位点，并且能够激活其表达。

为了进一步验证OsRbohB基因在OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12通路中介导BPH抗性的作用，在ARF12KO-1背景中过表达OsRbohB，发现这些转基因植物对BPH的抗性得以恢复。此外，通过对393DKO-1植物进行OsRbohB敲除实验，结果显示393DKO-1/RbohBKO植物对BPH更加敏感，表明393DKO-1植物的抗性依赖于OsRbohB基因。

总结来说，研究表明OsARF12直接激活OsRbohB基因的表达，进而在OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12信号通路中发挥作用，增强水稻对BPH的抗性。

图7 OsARF12对OsRbohB的转录调控，OsRbohB的遗传功能分析，及其与OsARF12和OsmiR393的遗传关系

6.ROS参与OsmiR393/OsTIR1信号介导的BPH耐药性

首先，研究表明ROS在植物防御反应的下游信号机制中发挥广泛作用。为了验证ROS是否在BPH抗性中起重要作用，首先用H₂O₂处理水稻植物，发现经过处理的植物在BPH侵染后存活率显著提高，且浓度越高，存活率越高。接着，测量了不同水稻品种中H₂O₂的含量，发现抗性品种RHT的基础H₂O₂含量高于易感品种9311，且在BPH侵染后，RHT的H₂O₂含量大幅上升，而9311的上升幅度则相对较小。

此外，还测量了过表达OsmiR393和基因编辑植物的H₂O₂含量，发现393DKO-1植物的H₂O₂含量明显高于NIP，而393bOE植物的基础H₂O₂含量与NIP相似。BPH侵染后，所有检测植物的H₂O₂含量均增加，393DKO-1植物的增加幅度显著高于NIP，而393bOE植物的增加幅度低于NIP。另一方面，OsARF12过表达及基因编辑植物的H₂O₂含量也被测量，结果显示ARF12OE植物的基础H₂O₂含量高于ZH11，而ARF12KO植物则低于ZH11。在BPH侵染后，这些植物的H₂O₂含量均有所增加，ARF12OE植物的增加幅度高于ZH11。

接下来调查了几种基因改造植物中几丁质是否能诱导ROS的产生，发现转换了OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12信号通路的植物（如393DKO、TIR1OE、IAA10KO和ARF12OE）中，几丁质诱导的ROS产生增强，而393aOE、393bOE、TIR1KO、IAA10OE和ARF12KO植物中则ROS产生受到抑制。这表明ROS激活与BPH抗性之间关系密切，并且这一激活与OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12-OsRbohB信号通路紧密相关。

研究者还测试了BPH抗性与ROS之间的关联，发现ARF12KO-1植物的BPH易感性可通过OsRbohB过表达得到补救，同时ARF12KO-1植物中低ROS水平得以恢复。此外，393DKO-1/RbohBKO植物对BPH的抗性较393DKO-1植物差，并且在393DKO-1/RbohBKO植物中，几丁质诱导的ROS产生也表现出显著下降。最后，研究证明OsmiR393在遗传上调控OsARF12以介导BPH抗性，同时在393DKO/ARF12KO植物中，几丁质诱导的ROS产生低于393DKO植物，进一步支持这一遗传关联。

总结而言，ROS在水稻对BPH的抗性中发挥关键作用，且通过OsmiR393、OsARF12和OsRbohB等基因间的相互作用，调控ROS的产生，从而增强植物的抗病能力。

图8 OsmiR393/TIR1-OsIAA10-OsARF12-OsRbohB通路中的ROS含量对BPH感染的反应