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研究者对84个配对样本进行全外显子测序，74个肿瘤和57个癌旁进行LF蛋白组，28个肿瘤和21个癌旁进行磷酸化蛋白组，26个肿瘤和16个癌旁进行转录组分析（图1a），发现了15个TFE3的融合配体（图1b），其中，PTPN12、ZNF627、EWSR1、PARP14、KHSRP、MATR3、RBM10、U2AF2和VCP是本队列中观察到的罕见TFE3融合配体。外显子测序结果中，BCDIN3D、NDRG1、ZNF668和GNPTG被确定为tRCC的显著突变基因（图1c）。蛋白组结果显示，共检测到14073个蛋白质，在肿瘤组织中有1487个特异蛋白，癌旁组织中有1115个特异蛋白（图1d），还鉴定到6469个磷酸化蛋白（图1e）。转录组测序确定了13313个基因，与蛋白组的Spearman相关性系数为0.39。基因富集分析显示，与mRNA-蛋白质正相关的基因富集于肾脏升高蛋白，Gly/Ser/Thr代谢和细胞基质受体相互作用，而负相关的基因富集于蛋白体和氧化磷酸化（图1f）。

图1 MiT家族tRCC的分子谱分析

PCA分析结果显示，两组样本在转录组（图2a）、蛋白组（图2b）、磷酸化蛋白组水平上都有显著区别。其中，TFE3的上调仅在蛋白水平上被观察到，而mRNA水平并无变化（图2c），TFE3的活性在肿瘤中也显著上调，且与肾脏特征呈负相关，表明TFE3在tRCC中肾脏特征的丧失起重要作用。

蛋白组水平上，肿瘤组织中有836个上调蛋白，891个下调蛋白（图2d），分别被富集到如图2e所示的通路中。转录组水平上，肿瘤组织中有1626个上调基因，1247个下调基因，且差异基因所富集到的代谢通路与蛋白质水平有一致性，但在mTOR信号和氧化磷酸化（OXPHOS）中，mRNA和蛋白质的表达存在显著的解偶联（图2f-g）。通过分析蛋白组数据，研究者筛选了22个候选的tRCC biomarker（图2h-i），其中DST和TBK1可作为区分tRCC和其他肾脏恶性肿瘤的潜在biomarker。此外，221个位点在肿瘤组织中显著上调，RPS6KB1是mTOR的一个重要效应器，该结果进一步支持了mTOR途径作为tRCC的潜在靶标，Trilaciclib是FDA批准的针对CDK5的药物，是治疗tRCC的潜在方法（图2j-k）。

图2 tRCC肿瘤的分子改变

为了确定内源和外源性诱变剂对tRCC基因的影响，研究者随后使用非负矩阵分解法研究了突变谱，确定了4个与肿瘤突变负担相关的突变特征，其中只有SBS6与染色体不稳定性和无进展生存期（PFS）有关，且在有SBS6的肿瘤中，DNA修复相关蛋白的表达量明显下调（图3a-d）。蛋白组数据分析结果显示，SBS6与OXPHOS呈负相关，与氧化损伤呈正相关，OXPHOS是线粒体功能的指标，线粒体受损后会导致ROS水平升高，从而诱发细胞氧化损伤，SBS6肿瘤中谷胱甘肽（GSH）合成相关酶受损，进一步加强了SBS6与tRCC氧化损伤的关联（图3e-g）。

综上，在SBS6特征的tRCC肿瘤中，线粒体功能障碍引起的ROS、GSH合成受损、DNA修复缺陷和DNA损伤增加造成了潜在的自我传播循环（图3h）。

图3 突变特征和相关信号通路的鉴定

研究者使用GISTIC鉴定了tRCC的体细胞拷贝数改变（SCNAs），确定了14个arm-level SCNAs，1p染色体上的细胞带包含频繁的删除焦点区域，1q21.1是唯一的扩增事件（图4a-b）。Cox回归结果显示6q和3p的缺失与总生存期（OS）下降相关，进一步的GSEA分析证明与3p拷贝数正相关的蛋白集中在吞噬作用上，负相关的集中在补体和凝血级联上（图4c-d）。在3p缺失的tRCC肿瘤中，参与自噬的蛋白被下调，与自噬负相关的ULKI S469磷酸化被上调(图4e)。自噬基因ATG7的丰度也被发现与MHC-II分子丰度呈正相关(图4f)。3p中另一个重要顺式效应发生在CTNNB1中，它是cadherin-catenin复合物的一部分，cadherin-catenin复合体大多数成分的下调与较差的PFS有关（图4g）。

综上，由于ATG7和CTNNB1上的顺式作用元件，3p缺失与免疫逃避和转移有关（图4h）。

图4 tRCC队列中的体细胞拷贝数改变分析

MiT家族tRCC中，TFE3融合瘤更具有侵略性，而TFEB融合瘤的预后较好。通过比对蛋白组数据，有20个蛋白在TFE3-tRCC中上调，518个在TFEB-tRCC中上调，TFEB丰度和活性在两组内存在显著差异，而TFE3并无类似差异（图5a-c）。富集分析结果显示，TFEB-tRCC中的糖酵解、葡萄糖生成、中性粒细胞脱颗粒、内吞作用、坏死作用和膜运输都被上调，钙调蛋白依赖性蛋白激酶的激活在TFE3-tRCC中被上调（图5d）。

在TFE3的不同融合类型中，上调蛋白、TFE3活性和肾脏特征均有所不同，其中ASPSCR1和LUC7L3的TFE3活性较高，而肾脏特征分数较低，证明这两种类型的融合瘤更具侵略性，且有更高的ISUP等级（图5e-i）。

图5 不同融合类型tRCC的分子异质性

tRCC被分为三个亚型（GP1、GP2和GP3），GP1的III&IV期肿瘤比例最高，而GP2的I&II期肿瘤比例最高。不同亚型在OS和PFS方面存在明显差异，GP1显示出最短的OS和PFS，GP3有较短的PFS但较长的OS，与此相对应，86.5%最终出现复发或转移的患者属于GP1和GP3（图6a-b），GP2的肾脏特征得分最高（图6c）。

通过比较基因组信息，9q和14q的缺失更频繁地发生在GP1，而12p和12q扩增则聚集在GP1和GP3。由于9q缺失是GP1的重要CNA特征，研究者随后分析了9q缺失的分子特征，GSEA分析显示，补体激活在9q缺失的肿瘤中被富集，而OXPHOS在没有9q缺失的肿瘤中被富集（图6d-e）。ATP6V1G1（9q32）显示出明显的RNA顺式效应，其丰度与临床结果也显著相关（图6f-g）。因此，9q基因缺失可能导致顺式和反式作用的OXPHOS下调，进一步影响了患者的临床结果。

图6 tRCC的蛋白质组亚型及其与遗传特征和临床结果的关系

本文使用86份配对样本，通过分析不同样本集的基因组学、转录组学、Label Free蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白质组学数据，揭示了有缺陷的DNA修复在tRCC致癌和进展中起着重要作用，代谢过程在mRNA和蛋白质水平上都明显失调，蛋白质组学和磷酸化蛋白质组数据还将mTOR信号通路确定为潜在的治疗靶点，该项研究结果为tRCC的生物学基础、疾病诊断、预后评估和治疗选择提供了新的见解。