行业动态

水果发育是高等植物生命周期中的一个独特过程，有助于代谢物的产生，为人类提供富含促进健康的化合物的饮食。目前果实发育虽已在作物领域获得广泛关注，但对多年生果树背后的代谢调节网络仍然知之甚少。

不同发育阶段的梨果肉

代谢组、蛋白质组、转录组、DNA甲基组和小RNA谱

作者在果树开花后4周～24周，每2周收集一次梨果肉，标记为S1~S11。首先对单果重量、纵向和横向直径、可溶性糖和乙烯含量进行统计，结果呈逐渐增加趋势，乙烯含量在S10和S11时大幅增加。代谢组学分析共鉴定出492种代谢物，对差异代谢物（DEM）进行分析，结果表明，其积累趋势呈现8个簇，如辛醇在早期含量较高，这与果肉的木质化有关；L-丙氨酸、L-苯丙氨酸和L-缬氨酸在S6和S7含量较高，可能与果实增大有关；S10和S11中ABA、乙烯和可溶性糖含量较高，这些与果实的成熟有关。

对相邻两个阶段的差异代谢物进行分析，结果表明，早期阶段的过渡期在代谢物种类上的差异更明显，且早期果实增大和后期果实成熟所对应的代谢物存在差异。

图1 梨果肉发育过程中的代谢组学分析

为了建立基因对代谢调控之间的关系网络，作者对梨果肉样本进行了转录组和蛋白质组检测，并与代谢组学进行了联合分析。蛋白质组共检测到5106种蛋白质，对每个阶段的差异蛋白（DEP）进行分析，共得到3469种差异表达蛋白（图2a）。对DEP和DEM进行联合分析，采用皮尔逊相关系数，得到2513个差异蛋白与423个差异代谢物相关。转录组测序共得到33051个基因，分析得到22055个差异基因(DEG)（图2b）。对DEG和DEM进行联合分析，采用皮尔逊相关系数，得到14399个差异基因，包含2218个差异蛋白编码基因与439个差异代谢物相关。

剔除在转录和翻译水平与代谢物不一致的争议基因后，作者构建了一个全面的基因-代谢物数据库，包含了101种代谢物的途径信息，其中有63种与其途径基因呈正相关或负相关。比如花青素-3-半乳糖苷与各种花青素生物合成基因呈正相关（图2c），蔗糖和葡萄糖与糖代谢相关基因呈正相关（图2d），ABA与其生物合成基因呈正相关（图2e）等。

为了研究各种代谢途径的潜在调节，作者构建了每个代谢物簇中不同类别代谢物间的调控网络（图2f），比如在检测到的10个与10个与ABA生物合成的基因，其中8个与蔗糖和葡萄糖也有关。

图2. 梨果肉转录组、蛋白质组和代谢组综合分析

对果肉样本进行DNA甲基化测序，共得到39016459个胞嘧啶甲基化位点。在果肉发育过程中，DNA甲基化水平在整个基因组和CHH区域逐渐增加（图3a）。

为了研究DNA甲基化对基因表达的影响，作者发现6209个差异基因的表达水平与其对应启动子中胞嘧啶甲基化水平相关（图3b）。为了验证这一点，作者用50 mM 5-azacytidine（5'-AZa）一种DNA甲基化抑制剂处理梨肉愈伤组织（图3c），通过DNA甲基化测序和转录组测序，结果表明，处理后胞嘧啶甲基化水平降低，其中1328个基因的表达水平与DNA甲基化相关(图3d)。

为了确定果肉中DEG启动子中的甲基化区域，在各阶段之间分析了富含胞嘧啶甲基化位点的区域的甲基化水平。在果肉中35,176个基因的启动子中，共发现了178499个DMR（图3e）。在排除S1和其他阶段之间没有差异表达的基因后，发现56.67%至78.17%的基因在果实愈伤组织中被5’-Aza处理抑制，与S1相比，在后期（从S3到S11）的发育果实中表达更高（图3f）。这些结果表明，这些18672个DEG的表达可能被果肉中的DNA甲基化所修饰。值得注意的是，95.58%的这些DEG被CHH-DMR修饰（图3g），表明与CG和CHG-DMR相比，CHH-DMR可能在修饰果肉中的全基因组基因表达方面发挥更重要的作用。

图3. 梨果肉发育期间DNA甲基化参与基因转录

为了阐明梨肉发育期间DNA甲基化增加的潜在机制，作者最初采用系统发育分析来识别涉及RdDM通路的基因，以及DNA甲基转移酶基因，但未发现其与DNA甲基化水平的相关性。

植物甲基化的调节涉及DNA甲基化和DNA脱甲基化过程之间的动态相互作用。为了确定梨果肉中DNA脱甲基酶基因的表达模式，作者从梨基因组中确定了拟南芥ROS1基因的八个梨同源体。在这些基因中，PbDME1.1、PbDME1.2和PbDME1.3在果肉中没有表达，PbDME1.4、PbDME1.5和PbROS1.3的表达水平在肉体发育过程中逐渐下降（图4a）并与C和CHH甲基化水平呈负相关（图4b）。此外，PbROS1.1和PbROS1.2的表达水平在果肉中逐渐从S5下降到S11（图4a）。这些结果表明，这五个基因的表达减少与梨肉发育过程中DNA甲基化的增加是一致的（图4c）。

此外，考虑拟南芥IDM1在催化组蛋白H3K18乙酰化方面的作用，以创造一个促进ROS1功能的染色质环境，作者从梨基因组中确定了拟南芥IDM1基因的三个梨同源基因。PbIDM1.1、PbIDM1.2和PbIDM1.3的表达水平在肉体发育过程中也逐渐下降（图4a）并与C和CHH甲基化水平呈负相关（图4b）。因此，所有三个IDM基因表达下调与果肉发育过程中DNA甲基化水平升高一致。总之，这些发现表明，梨肉发育过程中DNA甲基化水平的升高可能源于DNA脱甲基相关基因的表达下调。

图4. 梨果肉发育过程中脱甲基酶基因的表达减少与DNA甲基化的增加一致

为了说明这些DAMs与DEGs启动子中的DNA甲基化之间的关系，作者进行了相关分析，揭示了3987个DEGs启动子中的DNA甲基化与所有八个集群中存在316个DAM相关。结果表明，DNA甲基化可能通过影响参与代谢物合成相关基因的表达，在调节果肉代谢物方面发挥作用。

此外，鉴定出大多数与ABA、蔗糖和葡萄糖的合成和代谢过程相关的DMR修饰的DEG，以及部分DEG启动子中的DNA甲基化，甚至在整个基因组中，与ABA、蔗糖和葡萄糖相关。ABA是一种重要的植物激素，通过增加可溶性糖（包括蔗糖和葡萄糖）含量和乙烯释放来促进梨果成熟。因此，DNA甲基化可能通过影响ABA生物合成来参与梨肉的发育。为了验证这一假设，在S9的果皮下用5'-Aza处理梨果肉（图5a），进行DNA甲基化测序，发现胞嘧啶甲基化水平下降（图5b）。与对照组相比，5'-Aza处理促进了叶绿素在果皮中的积累（图5c），导致果皮呈现绿色（图5a）。此外，与对照组相比，5'-Aza处理促进了ABA、β-胡萝卜素和叶黄素在肉中的生物合成（图5c）。这一结果表明，DNA甲基化参与类胡萝卜素代谢，并可能通过增加ABA的产生来加速果实成熟。

为了说明DNA甲基化对类胡萝卜素代谢的调节，对用5'-Aza和H2O处理的果肉进行了定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。在DMR修饰的DEG中，10个途径基因和35个TF的表达水平与ABA含量呈正相关。与对照组相比，通过5'-Aza处理，PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达水平在果肉中上调，而PbZDS1和PbSDR2表达没有显著差异（图5d）。这些结果表明，DNA甲基化抑制了PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达，以限制果肉中的ABA生产。与对照组相比，通过5'-Aza处理，PbZF1、PbHB3、PbERF、PbB3.1、PbZFP4、PbbZIP1、PbGRAS3、PbbHLH3和PbNAC1的表达水平在果肉中上调，而PbZFP2、PbHB1、PbHB2、PbIAA2、PbIAA3、PbbHLH2和PbbHLH1表达没有显著差异（图5d）。这些结果表明，DNA甲基化减少可能会促进几个TF的表达，以诱导PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达。此外，与对照组相比，PbIAA1和PbMYB1在果肉中下调5'-Aza处理（图5d），表明DNA甲基化减少也可以抑制基因表达。

图5 DNA甲基化参与梨果肉代谢

为了探究TFs对ABA生物合成的潜在参与，作者使用ABA生物合成基因的启动子进行了双荧光素酶实验。根据表达和DNA甲基化分析，总共选择了12个TF（图5d）。结果表明，在PbPSY、PbZDS1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO启动子的控制下，LUC基因被测试的12个TF中的至少三个显著激活（图6a）。这表明这12个TF可能会激活参与ABA生物合成的基因子集。

AAO是一种催化脱落醛转化为ABA的关键酶（图2e）。双荧光素酶测定表明，PbAAO启动子的活性可以增加属于五个不同家族的9个TF（图6a）。据报道，在这些家庭中，ZFP、Homeobox、MYB和bHLH TFs参与了水果成熟。为了测试这些家族中已识别的TFs与PbAAO启动子之间的直接相互作用，进行了双荧光素酶检测，并表明PbMYB1和PbbHLH1的可能结合区域位于上游区域内。进一步分析表明，PbHB1和PbHB2/PbHB3的可能结合区域位于上游区域内。酵母单杂实验表明，PbZFP1、PbHB1、PbHB2和PbHB3可以结合到PbAAO起始密码的-500 bp至-100 bp的上游区域（图6b）。电泳迁移率位移分析（EMSA）还表明，PbZFP1与含有C2H2型ZFP预测结合位点的探针A直接相互作用，而PbHB1、PbHB2和PbHB3可以在三个HB TF的已识别结合区域与探针B直接相互作用（图6c）。这些结果表明，这些TF可以与PbAAO启动子进行物理相互作用，以增强其活性。

此外，在过表达PbZFP1的果肉愈伤组织中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表达水平以及ABA含量显著增加（图6d，e）。其次在S9时，过表达PbZFP1的果肉中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表达水平以及ABA含量也有所增加（图6f，g），PbZFP1沉默的果肉中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表达水平以及ABA含量有所下降（图6h，i）。这些结果表明，PbZFP1在果肉中积极介导ABA生物合成。

图6. PbZFP1在果肉中积极介导ABA生物合成

从本文不难看出，完成植物生理机制（梨果实发育）的深度解析需在传统的单一组学视角基础上加以拓展。这种“代谢表型-蛋白功能-基因调控”的多层级耦合分析，不仅能验证代谢标志物的生物学意义，更可溯源其积累的驱动机制。

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