果实颜色是质量的关键指标，黄褐色和半黄褐色（部分黄褐色）是沙梨特有的颜色，其褐化程度会受基因型和环境因素影响，然而褐化的分子机制目前尚不清楚。2021年10月Plant J.在线一篇《Dissecting the molecular mechanism of russeting in sand pear (Pyrus pyrifolia Nakai.) by metabolomics, transcriptomics and proteomics》的研究论文。该研究采用非靶代谢组学、靶向代谢物检测，转录组学，iTRAQ蛋白质组学，PRM靶向蛋白质组学等方法，分析了不同基因型和人工降雨对梨果实褐变的影响，并研究褐化相关基因和蛋白质，创建了一个显示主要代谢物变化的综合分子网络。已经鉴定出许多与褐变有关的假定基因及其编码蛋白，其中一个PbHHT1 经实验证实与沙梨果实的褐变有关。这有望为今后深入研究梨和苹果等其他水果的褐变机理提供丰富的资源。
研究材料
黄褐色的‘早生新水’（ZS）、半黄褐色的‘翠冠’（CG）和绿色的非黄褐色的‘翠玉’（CY）梨。
技术方法
冻干果皮的荧光显微观察，LC-MS和GC-MS非靶代谢组学分析，代谢物靶向检测，RNA序列分析，iTRAQ蛋白质组学，PRM靶向蛋白质组学，定量实时PCR（qRT PCR）表达分析，PbHHT1基因的克隆、载体构建及在梨果实中的瞬时表达。
实验路线
研究结果
1. 沙梨果实褐变的表型分析
黄褐色是沙梨果实的一个独特特征，由于其果皮上软木脂片层的积累，不同基因型之间存在不同程度的褐变。ZS果皮的扫描电子显微镜（SEM）观察显示，角质层裂纹延伸至表皮细胞。半黄褐色CG果皮中，角质层裂纹填充了软木组织。绿色非赤褐色CY果皮中角质层光滑，没有明显的裂缝（图1A）。透射电镜（TEM）进行了观察表明，黄褐色和半黄褐色果皮的表皮细胞充满了絮状单宁细胞（TC）。降雨处理加剧了ZS和CG果实的黄褐色（图1B）。与未经降雨处理的对照组相比，半黄褐色CG果皮中的软木脂片层（SL）增大，而黄褐色ZS果皮中的SL变得更厚（图1E和1F）。
图1 ZS、CG和CY之间的表型差异。
2、沙梨果实中差异表达代谢物的分析
为鉴定与沙梨果实褐变相关的大分子，首先进行了UPLC-Q-TOF/MS代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示，同一黄褐色和半黄褐色果实的三个梨基因型之间以及降雨处理和非降雨处理对照之间存在明显差异。在黄褐色ZS和半黄褐色CG以及绿色非黄褐色CY果皮之间分别识别出611和430个DEM。KEGG富集分析表明，这些DEM是次级代谢产物生物合成的主要成分，如角质、木栓蛋白、蜡、长链脂肪酸和苯丙烷（图3A）。
图2 KEGG富集分析
图3 LC-MS分析ZS、CG和CY之间差异表达代谢物（DEM）
3、沙梨果皮的转录组分析
为了观察与褐斑相关基因转录水平的变化进行转录组分析。共发现7630份转录本在ZS和CY之间差异表达，CG和CY之间差异表达5171份， ZS-R vs ZS-C之间差异表达803份， CG-R vs CG-C之间的差异为1718。KEGG途径分析发现，两个基因型之间以及降雨处理样本之间共同存在的差异表达基因（DEG）涉及（1）次级代谢产物中的四条主要生物合成途径（2） 角质、角质层和蜡质层（3）极长链脂肪酸（4）苯丙烷。此外，在常见的DEG中也发现了编码ABC转运蛋白的基因（图S2）。
图4 通过RNA-seq分析差异表达基因（DEG）
4. 沙梨果皮蛋白质组分析
通过iTRAQ蛋白质组学分析差异表达蛋白（DEP）。将鉴定出的DEP与上述RNA序列分析中确定的DEG 进行比较，发现在蛋白质和转录水平上差异表达的4个候选基因：PbHHT1/PbHHT1、PbKCS10/PbKCS10、PbnsLTP3/PbnsLTP3和PbnsLTP4/PbnsLTP4。对这四种共表达DEP和DEG的相对表达水平进行了靶向蛋白质组学（PRM）分析，结果表明PbHHT1、PbnsLTP3 和PbnsLTP4的相对表达水平与其绝对表达水平一致，其中PbHHT1的表达增强，而与未经处理的对照相比，经降雨处理的黄褐色和半黄褐色梨果实的果皮中PbnsLTP3和PbnsLTP4显著降低（图5）。
图5 平行反应监测（PRM）鉴定相关核心蛋白。
5. PbHHT1在沙梨果实褐变中起着重要作用
接下来进行的实验，以验证PbHHT1在梨褐化中的功能。通过注射含有35S:PbHHT1的转基因细菌溶液，瞬时表达PbHHT1，与含有农杆菌（EV）、渗透缓冲液（MMA）和水的空载体进行对照比较。如图6A所示，注射35S:PbHHT1后，在CG果实的果皮上清楚地观察到含有转基因农杆菌的PbHHT1的果皮褐变（SL积累）和皮孔化。在CY果皮中观察到注射部位周围有丝状的黄褐色。在其他对照的果皮中没有SL积累和/或皮孔化（图6A）。
图6 PbHHT1在CG和CY梨绿色幼果中的瞬时表达触发了黄褐色化
6. 代谢组、蛋白质组和转录组数据的比较分析
通过将基因、蛋白质和代谢物转换并映射到KEGG数据库，识别出103个DEG、18个DEP和8个DEM在所有的赤褐色和非赤褐色对照样品之间是共存的。进一步分析表明，它们都参与次级代谢产物的生物合成途径（图7）。根据与DEG、DEP和DEM相关的特定代谢物，将这些DEG、DEP和DEM进一步分为5个簇（I-V）。簇I包括主要参与苯丙烷类化合物（CAD1、PER53、COMT1、BGLU17）生物合成的基因和蛋白质，角质、皮下脂肪和蜡质层，簇II（HHT1、KCS4、CER1），脂肪酸的簇III（ADH2、FAD2），类黄酮（LDOX、CHS）的簇IV和脂肪酸延伸的簇V（CUT1、KCS4、KCS2、KCS12）。在簇V（如CUT1、KCS4）中DEG、DEP和DEM的表达水平较低与相关对照组相比，在赤褐色和半赤褐色以及经降雨处理的果实中检测到了这些物质（图7）。
图7 降雨处理过的赤褐色ZS和半赤褐色CG中代谢的综合网
小结
为了进一步了解沙梨果实褐变的分子调控网络，该研究利用多组学技术比较了以下三个不同基因型梨之间褐变的差异：（1）三个不同基因型，即：黄褐色‘早生新水’梨（ZS）、半黄褐色‘翠冠’梨（CG）和绿色非黄褐色‘翠玉’梨（CY）；（2） 赤褐色ZS 2和半赤褐色CG果实的降雨和非降雨处理。结果表明在降雨增强的CG和ZS果实黄褐色果皮中，检测到PbP450 86B、PbHHT1、PbLACS4和PbFAR3的高表达水平。对PbHHT1的进一步功能验证证实了其在触发年轻半黄褐色CG梨果实过早褐变中的重要作用，证明了PbHHT1在褐变梨基因型的亚胚化中的积极作用。这可能是因为它可以“桥接”苯丙烷类生物合成途径和苏贝林生物合成途径，因此可以改变和协调沙梨果实中与黄褐色相关的不同基因的表达。
三黍项目
