背景
过去十年育种专家越来越关注木薯的遗传改良，特别是在提高直链淀粉与支链淀粉比例方面，但通过传统育种改良木薯淀粉很困难，需要利用基因编辑技术。前期研究发现SBE2是基因组编辑产生高直链淀粉木薯的合适目标。为了开发高直链淀粉木薯，研究利用双sgRNA CRISPR/Cas9系统实现了木薯中SBE2的基因编辑。从田间收获的突变体木薯与野生型相比，突变体的直链淀粉和抗性淀粉显著增加，从而导致储藏根中淀粉物理化学性质发生改变。该研究表明，CRISPR/Cas9介导的木薯淀粉生物合成基因突变是培育具有食品和工业应用价值淀粉新品种的有效途径。
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研究材料
野生型和突变系木薯
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技术方法
SBE的系统发育及保守基序分析
基于CRISPR/Cas9技术构建载体和产生SBE2木薯突变体
基因组DNA提取及突变分析
蛋白质提取、酶活性分析
淀粉提取及淀粉粒径分析
总淀粉、抗性淀粉和直链淀粉含量分析
淀粉糊化及热性能分析
淀粉支化度、链长分布和分子量的测定
X射线衍射分析
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研究结果
1、 木薯SBE2基因双sgRNA定向敲除
从NCBI GenBank获得了不同植物种SBE的基因组和氨基酸序列。通过ClustalW对多个氨基酸序列进行比对，并在MEGA 7中构建了系统发育树。设计了两种不同的sgRNAs靶向SBE2的第二外显子和第五外显子，以保证靶基因编辑，通过根癌农杆菌介导胚性愈伤组织（FEC）转化，利用潮霉素筛选法获得43个转基因木薯植株系，大多数转基因株系都有SBE2基因突变，突变率为93.02%（40/43）。根据其编码序列可分为8个突变系（图1）：纯合突变株系1（M1）、突变系2（M2）、突变系3、4和5（分别为M3、M4和M5）为杂合子、突变株系6和7（M6和M7）为纯合突变、突变系8（M8）具有双等位基因突变。
图1 木薯SBE2基因组DNA序列的突变
2、木薯SBE2基因突变对田间植物生长的影响
为了探索SBE2突变是否对生长有影响，将野生型（WT）和八个SBE2突变系（称为M系）在田间种植6个月。与野生型相比，M1-M3在内的一些品系的生长明显减少。野生型和突变体的储藏根表型，即根生物量、根长、根直径和根数（图2a-e）也不同。平均储藏根数约为7～8根，未发现WT和突变系之间存在显著差异（图2a，e）。
图2 野生型和突变体木薯植株的表型
3、 敲除SBE2的突变体直链淀粉含量较高
为了验证SBE2，从储藏根中提取总蛋白进行免疫检测后发现，SBE2蛋白在M6-M8中未检测到，且仅M1中的含量高于WT。PAGE显示，SBE2的酶活性在大片段缺失突变株中发生了显著变化（图3a）,而SBE1蛋白的酶活性在所有突变株中均未受到影响(补充图S2)。
同时结果也表明，M6-M8的直链淀粉以及抗性淀粉高于WT，而总淀粉更低（图3&补充图S3a），且碘染色的结果图（图3d）以及分支度的结果（补充图S3b-d）均证实了SBE2蛋白是木薯淀粉分支的关键蛋白，但对表征无太大影响。
图3 SBE2突变木薯的SBE2蛋白检测和淀粉特性
4、 SBE2突变体的糊化特性
利用RVA对SBE2突变株的淀粉糊化特性进行了分析。总体而言，高直链淀粉的M6-M8比WT更容易回生。热浆粘度（HPV）反应了抗剪切力的削弱，并且M6-M8的HPV值是WT的2倍，且糊化时间以及糊化温度均为WT的两倍，表明淀粉的糊化速度较慢（图4a，表2）。可见高直链的木薯淀粉需要更高的糊化温度。
图4. SBE2突变木薯淀粉的糊浆和热特性
表2. SBE2突变木薯储藏淀粉的粘度特性
与WT相比，M6-8的糊化起始温度及峰值温度更高，表明M6-M8更加难以糊化。而终止温度以及热焓值显示各样本间无显著差异。（图4b，表3）
表3.SBE2突变木薯的DSC特性
5、 SBE2突变体的结晶特性
与WT相比，SBE2突变体的淀粉表现出不同的结晶度类型(图5)。WT具有A型峰的典型特征，而M6-M8突变体淀粉为典型的B型淀粉，但M1-M5则是处于A-B型淀粉的过渡阶段。
图5. SBE2突变木薯淀粉的X射线衍射图
通过离子色谱测定了淀粉的链长分布。结果表明，与WT相比，M1-M5的长链增加明显，而短链和中长链则略有下降，并且与M1-M5相比，M6-M8的支链短链较少，长链较多（图6），表明木薯SBE2主要作用于储藏根中支链短链的形成。
但是所有突变的淀粉颗粒大小均没有显著变化。通过GPC结果可以看出，M6-M8的支链的中长链和直链淀粉远高于WT（图7，表4），这和比色法估计的直链淀粉含量一致（图3b）。
图6. 野生SBE2突变型木薯淀粉支链长度分布的比较
图7. SBE2突变木薯的凝胶色谱图
表4. SBE2突变木薯淀粉的凝胶色谱(GPC)参数研究
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小结
该研究报告了通过CRISPR/Cas9介导的SBE2基因突变产生抗性淀粉增加高直链淀粉木薯，高直链木薯淀粉的糊化特性、链长分布和结晶度等理化性质及结构发生了改变。这些具有不同性质的高直链淀粉木薯淀粉可用于特定的工业领域。研究所获得的新材料可作为亲本，通过在不同转基因系之间进行适当的自交或杂交，分离性状，并在后代中消除Cas-9基因，产生无外源基因的植株。
